Immunologiska studier på patienter med metastaserad prostatacancer - Svenska folkfonden

Sök »
Till innehåll

Huvudmeny:

Immunologiska studier på patienter med metastaserad prostatacancer

 
Docent Andreas Lundqvists forskningsprojekt på  Institutionen för Onkologi-Patologi, Karolinska Institutet, syftar till att förstärka immunförsvaret hos patienter med prostatacancer

Mål
Immunförsvaret skyddar oss mot infektioner. Det finns tydliga resultat som visar att immunförsvaret spelar en stor roll att skydda oss mot cancer. Detta har lett till utveckling av behandlingar som syftar till att förstärka immunförsvaret i patienter med cancer. Denna form av behandling sk. immunterapi har visat lovande resultat i patienter med avancerad cancer. Flertalet studier har även visat att aktivering av immunsystemet kan vara fördelaktigt för patienter med prostatacancer (PC). En mycket viktig komponent av immunförsvaret som begränsar tumörtillväxt är den sk. NK cellen. Dock är tumörceller mycket immunosuppressiva och kan rekrytera suppressiva celler som kan försvaga immunsförsvaret. Exempel på en sådan suppressorcell är den sk regulatoriska T cellen.

I preliminära experiment ser vi att behandling med zoledronsyra resulterar i en ökad aktivitet hos NK celler och minskad frekvens av regulatoriska T celler. Vår hypotes är att behandling med zoledronsyra aktiverar NK celler och samtidigt försvagar den suppressiva effekten av regulatoriska T celler aktiviteten och att detta kan leda till bättre immunterapibehandlingar för patienter med metastaserad PC. Syftet med denna studie är att analysera frekvensen av regulatoriska T celler och NK celler hos patienter med PC efter behandling med zoledronsyra. Vi har även som måluppfyllelse att identifiera de mekanismer som ligger till grund för eden minskade frekvensen av regulatoriska T celler efter behandling med zoledronsyra. Dessa resultat kommer att lägga grunden för att införliva ZA som en immunförstärkande modalitet hos patienter med metastaserad PC.

Bakgrund, preliminära resultat, och publicerade resultat
Prostatacancer (PC) är den vanligaste cancerformen i Sverige. Trots intensiv behandling är medianöverlevnaden för dessa patienter 9-30 månader [1]. Därför behövs förbättrade terapier för patienter med metastaserad PC. Immunterapi syftar till att stärka immunförsvaret mot cancer. Under 2004 rapporterade vi den första kliniska prövningen av ett DNA-baserat vaccin som aktiverar kroppens T celler mot prostataspecifikt antigen (PSA). Terapin var säker och cellulärt och humoralt immunsvar mot PSA-protein observerades och tre (3/8) patienter visade en tydlig minskning i PSA-nivåer [2]. Under senare år har flera olika former av immunterapistrategier utvärderats hos patienter med cancer och många av dessa har genererat långvariga läkande effekter. År 2013 blev det första cellbaserade cancervaccinet (PROVENGE®) godkänt för behandling av patienter med metastaserad PC i Europa. Behandling med PROVENGE® visade en signifikant ökning medianöverlevnad på 4-6 månader i en randomiserad fas III placebokontrollerad studie på patienter med asymtomatisk metastaserad hormonrefraktär PC [3].

PC celler uttrycker antigen som kan kännas igen av immunsystemet. Dock är det vanligt att cancerceller flyr undan immunsvaret genom att nedreglera uttrycket av dessa antigen eller nedreglera vävnadsantigenet MHC I [4]. Sådana tumörer är osynliga för tumörspecifika T celler och behandling med PROVENGE® skulle sannolikt inte inducerar några kliniska svar. Istället blir dessa MHC I negativa tumörer känsliga för attack av NK celler. I PC patienter som behandlats med hormonbehandling framgår att frekvensen av NK celler i tumörvävnad är signifikant associerad med en lägre risk för tumörprogression [5]. Ett annat gemensamt drag för många cancerformer, inklusive PC, är en hög frekvens av regulatoriska T celler i tumörens mikromiljö. De inhiberar immunsystemet genom att producera stora mängder av TGF-beta eller genom utarmning av tillväxtfaktorn interleukin-2 (IL-2) [6]. En nyligen genomförd studie visade att patienter med ett högt antal regulatoriska T celler i prostatatumörmiljön har en ökad risk att avlida av PC [7]. Sammantaget så spelar NK celler och regulatoriska T celler en mycket viktig roll hos patienter med PC och genom att förstärka aktiviteten hos NK celler och minska den suppressiva effekten av regulatoriska T celler kan bättre immunterapibehandlingar utvecklas för patienter med PC.

Zoledronsyra är en osteoklasthämmare som används för att förhindra skelettkomplikationer hos patienter med skelettmetastaser. Det är väl känt att zoledronsyra kan aktivera gammadelta T celler. Vi visade nyligen att behandling med zoledronsyra resulterar i signifikant ökad antitumöraktivitet av NK celler i vävnadsodlong och hos tumörbärande möss [8]. I preliminära experiment ser vi också att de suppressiva effekterna av regulatoriska T celler är försvagade. I dessa experiment ser vi att regulatoriska T celler uttrycker miskade nivåer av IL-2-receptorn CD25 efter behandling med zoledronsyra. I denna forskningsansökan kommer vi undersöka om regulatoriska T celler som behandlas med zoledronsyra är mindre suppressiva på grund av begränsad IL-2 utarmning in vitro.

För att gå vidare i vår forskning har vi påbörjat att undersöka hur NK celler och regulatoriska T celler påverkas av behandling med zoledronsyra i patienter med metastaserad cancer. I preliminära resultat har vi sett att antalet NK celler samt produktionen av den inflammatoriska cytokinen IFN-gamma var signifikant högre efter behandling med zoledronsyra. Vi observerade dessutom uttrycket av flera aktiveringsmarkörer på NK-celler inklusive CD16, NKp46, CD69, TRAIL före och en vecka efter behandling med zoledronsyra på NK-celler var uppreglerade.

Vi har dessutom observerat att frekvensen av regulatoriska T celler minskar hos alla patienter en vecka efter behandling med zoledronsyra. Frekvensen av regulatoriska T celler var 5,4% och 4,1% före och efter behandling med zoledronsyra (p = 0,008) (figur 1). Sammantaget så visar våra preliminära resultat att behandling med zoledronsyra aktiverar NK celler och minskar frekvensen av regulatoriska T celler hos patienter efter behandling med ZA.
 
 
Figur 1

Aktivering av NK celler och inhibering av regulatoriska T celler efter behandling med zoledronsyra.
Blod från patienter före och en vecka efter behandling med ZA analyserades med avseende på frekvens av CD3 + CD4 + Foxp3 + tregs, frekvens av prolifererande Ki67 + NK-celler, och inflammatorisk IFN-gamma producerande NK-celler.
 
 
Med tanke på deras centrala roll i tumörimmunologi, ägnas en stor mängd forskning att utveckla strategier för att selektivt eliminera regulatoriska T celler hos patienter med cancer. Våra preliminära resultat som visar att zoledronsyra selektivt kan minska frekvensen av regulatoriska T celler är ett sätt att utveckla förbättrade terapier baserade på aktivering av immunsystemet hos patienter med PC. Det är av stor vikt för att karaktärisera mekanismen hur regulatoriska T celler selektivt försvagas av zoledronsyra för att kunna utveckla mer potenta läkemedel. Dessutom skulle det vara av stort prognostiskt och potentiellt även prediktivt värde att jämföra frekvesen av regulatoriska T celler och NK celler med kliniska parametrar som total överlevnad, tid till progression, och sjukdomsfri överlevnad hos patienter som behandlas med zoledronsyra. 

Arbetsplan
För att bekräfta och och förstärka våra preliminära resultat behöver vi samla in data från fler patienter. För att identifiera de mekanismer som ligger bakom hur zoledronsyra försvagar regulatoriska T celler behövs en djupgående analys i odlings-system med humana PC-cellinjer, isolerade regulatoriska T celler, T celler och NK celler.

Analys av regulatoriska T celler och NK celler hos patienter med PC efter behandling med zoledronsyra
Efter informerat samtycke, kommer helblod (30 ml) samlas innan den första dosen av zoledronsyra i hepariniserade rör. Blod (30 ml) kommer att samlas en vecka efter den första dosen av ZA (godkänd etisk tillstånd EPN Stockholm, dnr: 2013/829-31/3). Blodceller från patienter färgas med fluorescens-konjugerade antikroppar för markörer som uttrycks på NK celler och regulatoriska T celler. Infärgade prover kommer att analyseras med flödescytometri (BD LSRII). I våra preliminära experiment utvärderade vi 10 patienter (PC (n = 2), bröstcancer (n = 5), njurcancer (n = 2), urinblåsecancer (n = 1)). Vi kommer nu att fokusera vår analys och rekrytera fler patienter med PC till studien. Det är svårt att tillämpa power-beräkningar eftersom resultaten är i form av flera olika immunologiska mätmetoder. Vi förväntar oss att rekrytera 15 patienter under 2015. I detta material kommer vi att undersöka frekvensen och aktiviteten hos regulatoriska T celler och NK celler innan och efter behandling med zoledronsyra och analysera dessa resultat mot kliniska parametrar inklusive; stadium och grad av sjukdom, total överlevnad, etc.

Vi kommer även i detta material analysera halterna av immunsuppressiva faktorer (TGF-beta, IL-10, etc.) och immunaktiverande cytokiner (IFN-gamma, IL-2, TNF-alfa etc.). Denna analys är viktigt eftersom det kan visa på förändringar i cytokinnivåer efter behandling med zoledronsyra. Dessa förändringar kan potentiellt användas som en prognostisk indikator på sjukdomens förlopp. Vi kommer inledningsvis analysera redan nedfruset serum för produktion av flera cytokiner (n = 42) med multiplex Luminex-bead array analys. Därefter kommer cytokiner som visar signifikanta förändringar (upp- eller nedreglering) efter behandling med zoledronsyra analyseras med ELISA i samtliga retrospektiva och prospektiva prover. Överblivet material från samtliga patienter kommer att förvaras i en biobank vid Cancercentrum Karolinska för framtida forskningsbruk.

Undersöka mekanismen för försvagning av regulatoriska T celler efter behandling med zoledronsyra
regulatoriska T celler isoleras från perifert blod från patienter med PC genom magnetiska kulor och därefter odlas i IL-2 med eller utan zoledronsyra i fem dagar. För att bekräfta att regulatoriska T celler är mindre suppressiva efter behandling med zoledronsyra kommer de att odlas tillsammans med NK celler. Därefter kommer aktiviteten hos NK celler analyseras i 51Cr-release test (för att mäta den tumördödande affakten hos NK celler), CFSE och 3H-tymidin analyser (för att mäta proliferation av NK celler), och flödescytometri och ELISA (för att mäta produktionen av inflammatoriska cytokiner av NK celler).

För att karaktärisera mekanismen hur zoledronsyra försvagar effekten av regulatoriska T celler kommer vi att undersöka obehandlade och zoledronsyra-behandlade regulatoriska T celler i flera olika analyser. I preliminära experiment har vi observerat att uttrycket av IL-2-receptorn CD25 nedregleras i zoledronsyra-behandlade regulatoriska T celler jämfört med obehandlat regulatorisk T celler. För att bekräfta dessa observationer kommer vi att analysera uttrycket av CD25 med flödescytometri.
Vi har också sett att transkriptionsfaktorn NFAT reducerades after behandling med zoledronsyra. Det är känt sedan tidigare att NFAT-proteinet lokaliseras i kärnan och binder till FoxP3 för att öka den suppressiva effekten hos regulatoriska T celler. Vi kommer att undersöka uttrycket av NFAT genom konfokalmikroskopi av obehandlade och zoledronsyra-behandlade regulatoriska T celler. Nyligen publiceradeds resultat att signalering via mTOR ökar den cellulära metabolismen och att mevalonat-signaleringsvägen är särskilt viktigt för att öka proliferationen av regulatoriska T celler [9]. Eftersom zoledronsyra förändrar mevalonat-signaleringsvägen hypotiserar vi att zoledronsyra även förändrar den metaboliska aktiviteten hos regulatoriska T celler. För att testa denna hypotes vi kommer att tillämpa Seahorse-flödesanalysteknik för att undersöka den mitokondriella respirationen och glykolys i obehandlade och zoledronsyrabegandlade regulatoriska T celler. Vi har även preliminära resultat som tyder på att zoledronsyra inducera apoptos i regulatoriska T celler. Vi kommer därför att undersöka nivåer av apoptos genom att färga in regulatoriska T celler före och efter behandling med zoledronsrya med AnnexinV och 7-AAD markörer för analys med flödescytometri. Vi räknar med att dessa experiment kommer att ge svar på hur zoledronsyra försvagar regulatoriska T celler.

Förväntat utfall och betydelse
Infiltration av regulatoriska T celler är en välkänd observation i flera solida cancerformer inklusive PC. Dock är analysen av NK-cellsaktivitet hos patienter med metastaserad PC ett område som inte studerats i någos större utrsträckning tidigare. Nyligen publicerades resultat att hög NK cellaktivitet är förknippad med förlängd överlevnad vid nyligen diagnostiserad metastaser PC [10]. I linje med dessa resultat förväntar vi oss att patienter med ett bra immunologiskt svar efter behandling med zoledronsyra, dvs hög NK cell aktivitet och låg frekvens av regulatorisk T celler, kommer att ha en bättre prognos. Selektiv eliminering av regulatoriska T celler är mycket önskvärt. Genom att identifiera hur zoledronsyra selektivt försvagar regulatoriska T celler kan förbättrade läkemedel utvecklas. Vidare kan resultaten från detta projekt identifiera prognostiska och prediktiva biomarkörer hos patienter med PC.

Referenser
  1. Kirby, M., C. Hirst, and E.D. Crawford, Characterising the castration-resistant prostate cancer population: a systematic review. Int J Clin Pract, 2011. 65(11): p. 1180-92.
  2. Pavlenko, M., et al., A phase I trial of DNA vaccination with a plasmid expressing prostate-specific antigen in patients with hormone-refractory prostate cancer. Br J Cancer, 2004. 91(4): p. 688-94.
  3. Small, E.J., et al., Placebo-controlled phase III trial of immunologic therapy with sipuleucel-T (APC8015) in patients with metastatic, asymptomatic hormone refractory prostate cancer. J Clin Oncol, 2006. 24(19): p. 3089-94.
  4. Blades, R.A., et al., Loss of HLA class I expression in prostate cancer: implications for immunotherapy. Urology, 1995. 46(5): p. 681-6; discussion 686-7.
  5. Gannon, P.O., et al., Characterization of the intra-prostatic immune cell infiltration in androgen-deprived prostate cancer patients. J Immunol Methods, 2009. 348(1-2): p. 9-17.
  6. Gasteiger, G., et al., IL-2-dependent tuning of NK cell sensitivity for target cells is controlled by regulatory T cells. J Exp Med, 2013. 210(6): p. 1167-78.
  7. Davidsson, S., et al., CD4 helper T cells, CD8 cytotoxic T cells, and FOXP3(+) regulatory T cells with respect to lethal prostate cancer. Mod Pathol, 2013. 26(3): p. 448-55.
  8. Sarhan, D., et al., Activated monocytes augment TRAIL-mediated cytotoxicity by human NK cells through release of IFN-gamma. Eur J Immunol, 2012.
  9. Zeng, H., et al., mTORC1 couples immune signals and metabolic programming to establish T(reg)-cell function. Nature, 2013. 499(7459): p. 485-90.
  10. Pasero, C., et al., Highly functional natural killer (NK) cells as predictive biomarkers associated to long response to castration in newly diagnosed metastatic prostate cancer. J Clin Oncol, 2014. 32((suppl; abstr e16025)).
 
 
 
Tillbaka till innehåll | Tillbaka till huvudmeny